Adattamenti all’acqua salmastra: una nuova specie di Protosuberites

 

Adattamenti all’acqua salmastra: una nuova specie di Protosuberites (Porifera: Demospongiae: suberitidae) dalla Grotta Del Bue Marino (Dorgali, Cala Gonone) e un primo contributo allo studio delle relazioni filogenetiche all’interno di questo genere.


Autori

Paolo Melis - Istituto Zooprofilattico della Sardegna, Via Kennedy, 2 - 08100 Nuoro – Italia.

Ana Riesgo & Sergi Taboada – Department of Life Sciences, Natural History Museum of London, Cromwell Road London, SW7 5BD, England.

Renata Manconi - Dipartimento di Scienze della Natura e del Territorio (DIPNET), Università di Sassari, Via Muroni, 25 - 07100 Sassari, Italia.

 

Riassunto Questo lavoro parla della scoperta di una nuova specie di spugna appartenente al genere Protosuberites e proveniente dalla Grotta del Bue Marino (Golfo di Orosei, Mar Tirreno occidentale) usando un approccio tassonomico integrativo che, combinando informazioni morfologiche e molecolari, ha permesso di caratterizzare lo status tassonomico e collocare questa nuova specie mediterranea all’interno del contesto filogenetico proprio del genere Protosuberites.

 

 

Introduzione

La vasta area carsica della Sardegna centro-orientale rappresenta un hot-spot di biodiversità con alti valori di endemicità per la fauna cavernicola terrestre e d’acqua dolce.

La Grotta del Bue Marino (Cala Gonone, Dorgali, Nuoro, 40°14’51” N, 9°37’29” E, 12 SA/NU nel Catasto Speleologico Regionale della Sardegna) è il più vasto di questi sistemi carsici oltre a rappresentare un’importante meta turistica (ca. 60.000 visitatori/anno).

La grotta, con profilo quasi orizzontale, è divisa in tre rami (Ramo Nord, Ramo Centrale e Ramo Sud) e si apre sul Mar Tirreno con un ingresso che rappresenta l’estuario sotterraneo di un grande sistema acquifero.

Il primo tratto del Ramo Sud, partendo dall’ingresso marino, chiamato anche Ramo Turistico, ha un’estensione di circa 900 m e termina in prossimità di una diga calcarea, la quale, presentando un dislivello di quasi un metro, blocca la risalita del cuneo salino che procede dall’esterno verso l’interno della grotta, spinto dal moto ondoso e dalle fasi di marea.

In questo tratto la grotta è semisommersa (profondità 0,30-4,5 m) e completamente oscura dopo i primi 100 m.

La sintopica presenza di un apporto di acqua dolce dal sistema idrico sotterraneo, variabile durante le fasi dell’anno (fasi di secca, piena e morbida) e di acqua salata dal mare, fa sì che in questo tratto di grotta i parametri fisico-chimici dell’acqua (salinità, pH, OD) varino sensibilmente tra gli anni e durante le stagioni.

Negli anni caratterizzati da forti piogge la grotta è invasa da acqua dolce corrente, proveniente dal sistema acquifero sotterraneo. Inoltre nelle stagioni di minima portata dell’acquifero è presente una costante stratificazione della colonna d’acqua con valori di salinità, pH e conducibilità diversi alle differenti profondità.

Questo tratto di grotta può essere considerato grotta d’estuario sensu De Waele e Forti (2003), definizione che in parte corrisponde a quella di ambiente anchialino (Riedl 1966; Holthuys 1973; Sket 1996).

La conoscenza dei livelli di diversità biologica di questi ambienti è estremamente scarsa a livello globale (Manconi et al. 2012, Melis 2013, 2015).

Riportiamo in questo lavoro la scoperta di una nuova specie di spugna, proveniente dal Ramo Sud della Grotta del Bue Marino, appartenente al genere Protosuberites Swartschewsky, 1905 (ordine Suberitida).

Lo status tassonomico del genere Protosuberites è considerato problematico; comprende attualmente 23 specie valide (vanSoest et al. 2016), definite come “Suberitidae con habitus incrostante e scheletro coanosomale dotato di tilostili disposti singolarmente o organizzati in ciuffi, e scheletro ectosomale dotato di tilostili disposti a spazzola” (van Soest 2002, p. 235).

La delineazione di specie all’interno del genere Protosuberites è perciò resa difficile dal fatto che queste spugne posseggono solo tislostili, variabili in forma e grandezza, come unico carattere diagnostico. Inoltre i confini tra una specie e l’altra sono spesso resi poco chiari dalla presenza di specie simpatriche che presentano sovrapposizioni morfologiche dei principali caratteri diagnostici di riferimento (van Soest & de Kluijver 2003). In questi casi, l’analisi molecolare è cruciale per confermare e/o chiarire la filogenia e la sistematica in taxa considerati problematici (Blanquer & Uriz 2007; Erpenbeck et al. 2012; Escobar et al. 2012; Xavier et al. 2010).

  

Materiali e metodi

I campioni sono stati raccolti nel mese di Giugno 2008 e tra Giugno e Agosto 2013 lungo un transetto di ca. 900 m che, partendo dall’ingresso marino del Ramo Sud della grotta, termina in prossimità della diga calcarea.

I campionamenti sono stati effettuati tramite immersione con snorkel e/o autorespiratore, in acqua mixoalina (salinità da 24 ‰ a 39,6 ‰, variabile a seconda del punto, della profondità e del giorno di campionamento) a profondità variabili da 0,30 cm a 1 m.

I campioni di spugna sono stati prelevati tramite raschiamento del substrato roccioso e conservati in etanolo al 96%. In

laboratorio, i campioni sono stati puliti e separati da epibionti e frammenti di substrato grazie all’utilizzo di uno stereomicroscopio, quindi conservati a -20° C per le analisi molecolari.

Per ciascun esemplare, tramite stereomicroscopio (LM, Leica Stemi 2000) e microscopio a scansione (SEM, vega3 tipo Tescan LMU), sono stati valutati i principali morfotratti come forma di crescita, colore, aperture inalanti/esalante, superficie, struttura dello scheletro e la morfologia dei corpi di resistenza.

Per le analisi molecolari sono stati inclusi 19 individui appartenenti a 5 specie del genere Protosuberites e provenienti da aree geografiche distinte (Fig. 1).


Il DNATotale è stato isolato da ciascuna singola porzione di “tessuto” di spugna, usando appositi kit (DNeasy Blood e PEEDTOOLS tissue DNA Extraction).

Sono stati presi in considerazione 3 distinti marcatori molecolari; la subunità I del gene mitocondriale per l’ossidasi c (COI) e due geni nucleari ribosomiali, il 18S rRNA (sequenza completa) e il 28S rRNA (sequenza parziale).

Le sequenze sono state amplificate utilizzando specifici primer e i prodotti delle reazioni PCR spediti al Serveis Científico-Técnics della Universitat de Barcelona per il sequenziamento (BigDye Terminator e ABI Prism 3730 Genetic Analyzer).

Con il programma CLC Genomics Workbench v.5.1 (QIAGEN, Valencia, CA, USA), sono stati visualizzati i cromatogrammi e assemblate le sequenze geniche.

Ogni singola sequenza è stata comparata con il database GenBank utilizzando l’algoritmo BLAST (Altschul et al. 1997) e confermata l’appartenenza al phylum Porifera.

Per l’analisi filogenetica sono state aggiunte sequenze provenienti dal database ncbi Genbank, appartenenti a 4 outgroup distinti di Suberitidae: Prosuberites laughlini (Díaz Alvarez & van Soest 1987); Prosuberites longispinus Topsent,1893; Suberites domuncula (Olivi 1792) e Suberites pagurorum Solé-Cava & Thorpe 1986.

Tutte le sequenze sono state allineate con il programma MUSCLE (Edgar 2004) e gli allinementi implementati in jModeltest (Posada 2008) per selezionare il migliore modello evolutivo.

La maximum likelihood analysis (ML) è stata condotta in RAxML 7.4.2 (Stamatakis 2006) mentre la Bayesian inference analysis (BI) in MrBayes 3.2 (Ronquist et al. 2012).

Gli alberi risultanti sono stati combinati per trovare la massima probabilità “a posteriori”.

Il programma MEGA (Kumar et al. 2008) è stato usato per calcolare la distanza media inter ed intra cladi usando le distanze calcolate su base COI con varianza bootstrap.

 

Risultati

Systematic accounts

Class Demospongiae Sollas, 1885

Order Suberitida Chombard & Boury-Esnault, 1999

Family Suberitidae Schmidt, 1870

Genus Protosuberites Swartschewsky, 1905

Protosuberites mereui Manconi sp. nov.

Figure 1–3;


Descrizione

Forma di accrescimento incrostante, molto sottile (ca. 1–2 mm in spessore), distribuita a chiazze su substrato roccioso (da pochi cm² fino a 1m²). Colore da giallo tenue a giallo vivo, bianco una volta conservata in etanolo (Fig. 1), di consistenza solida. Superficie ispida con canali subdermali e osculi sparsi. Scheletro ectosomale privo di architettura particolare, cono spicule distali che supportano la membrane dermale. Scheletro coanosomale costituito da spazzole di tilostili, eretti singolarmente o raggruppati in ciuffi nelle sezioni più spesse (Fig. 2d). Piatto basale di spongina ben sviluppato e generalmente armato da teste di tilostili.

Tilostili aventi lunghezza da 100 a 650 μm (in media 295.3 μm) e da 3 a 10 μm in spessore (media 5.03 μm) (misurazioni effettuate su 200 spicole), appartenenti a 3 classi di taglia 130–180 μm; 280–330 μm; 380–430 μm, dritti o leggermente piegati, spesso sinuosi, interamente lisci, con teste subovali (4–11 μm in spessore, Fig. 2a, b, c). Sono presenti raramente dei piccolo e sinuosi tilostili con testa a fungo (110–232 x 0.5–1 μm). I subtilostili sono molto rari.

I corpi di resistenza (tipo gemmule) sono subovali, piatti e fermamente aderenti al substrato, raggruppati in piccoli gruppi (2–3) (Fig. 3). La teca dei corpi di resistenza è compatta (ca. 12 μm in spessore), con una superficie liscia priva di spicole (Fig. 3a1).

Durante la fase attiva i corpi di resistenza presentano un’apertura foraminale ben sviluppata, dotata di collare trasparente (430 μm lunghezza totale con collare) (Fig. 3).

Durante la fase inattiva i corpi di resistenza sono privi di foramen e di collare ma presentano una piccola area apparentemente priva di cellule, collocate in prossimità dell’asse maggiore della teca subovale (Fig. 3).

La popolazione di Protosuberites mereui sp. nov. si presenta distribuita in facies sparse (fino a 1 m²) presenti in acqua mixoalina, in condizioni di oscurità totale, all’interno del tunnel del Ramo Turistico Sud della grotta anchialino/d’estuario della Grotta del Bue Marino. In questa zona della grotta la salinità varia dal 24 ‰ al 39.6‰, a seconda del punto e del periodo dell’anno. Il substrato sul quale la specie cresce varia da pareti verticali di calcare a substrati artificiali come pilastri di cemento e teli di plastica, a profondità variabili tra 0.5–1 m di profondità. La nuova specie condivide lo stesso microabitat con il serpulide Ficopomatus enigmaticus (Fauvel, 1923), con una non identificata spugna Haplosclerida e con il kamptozoo Barentsia gracilis M. Sars, 1835, strettamente associato alla spugna suberitidae.

Protosuberites mereui sp. nov. è conosciuta solo nella sua località tipo, la Grotta del Bue Marino.

La specie è dedicata allo speleologo sardo Luigi Mereu, morto prematuramente durante l’esplorazione di una grotta, in riconoscenza del suo prezioso contributo alla realizzazione di questa ricerca.

 

Analisi molecolari

L’analisi molecolare ha preso in considerazione un totale di 3990 paia di basi per campione (551 bp per il COI, 2320 bp per il 18S e 1119 bp per il 28S) includendo un totale di 23 sequenze appartenenti a 6 specie di Protosuberites e a 4 outgroups (Suberites domuncula, Suberites pagurorum, Prosuberites laughlini e Prosuberites longispinus).

Per P. denhartogi e P. mereui sp. nov. abbiamo sequenziato il gene COI per 8 e 7 individui rispettivamente, e ottenuto 5 aplotipi per P. denhartogi e 3 aplotipi per P. mereui sp. nov.

Per il gene 28S, sono stati trovati 2 distinti aplotipi per P. mereui sp. nov., e 6 per P. denhartogi, mentre per il gene 18S, è stato trovato un solo aplotipo sia per P. mereui sp. nov. che per P. denhartogi.

Tutti I genotipi nucleari e mitocondriali sono stati depositati su GenBank.

La ricostruzione filogenetica del set concatenato di geni mostra una strettissima relazione tra una spugna proveniente da Panama (Protosuberites sp. ‘Panama’) e P. mereui sp. nov., con lo 0.99 di probabilità “a posteriori” e il 98% di bootstrap (Fig. 5). Il clade contenente sia Protosuberites sp. ‘Panama’ che P. mereui sp. nov., mostra una stretta relazione con quello contenente P. denhartogi, con 1 di probabilità a posteriori e il 100% di (Fig. 5).

Le distanze genetiche calcolate su base COI tra le specie di Protosuberites di questo studio sono state sempre maggiori del 2%.

La distanza genetica calcolata tra P. mereui sp. nov. e la specie più vicina, Protosuberites sp. ‘Panama’, è stata la più bassa (2.9 ± 0.8;), mentre quella tra Protosuberites sp. ‘Panama’ e P. ectyoninus è stata la maggiore (6.8 ± 1.1;).

 

Discussione

Protosuberites mereui sp. nov. della Grotta del Bue Marino è assegnato al genere Protosuberites Swartschewsky sensu van Soest (2002), sulla base della sua architettura scheletrica, caratterizzata da tilostili singoli o raggruppati in ciuffi.

La nuova specie è morfologicamente simile a P. denhartogi, che però ha una distribuzione geografica che interessa l’Atlantico nord-orientale, e a P. prototipus Swartschewsky, 1905, che è endemica del Mar Nero, ma si differenzia da queste per diversi caratteri.

Le morfometrie spicolari di P. mereui sp. nov. corrispondono parzialmente a quelle di P. denhartogi (van Soest 1977; van Soest & de Kluijver 2003) e a quelle di P. epiphytum del Mediterraneo (Pulitzer Finali 1983), ora identificato come P. denhartogi. Tuttavia, i piccoli tilostili, sottili e con corpo sinuoso e testa a fungo, presenti in P. mereui sp. nov., non sono mai stati riportati in Protosuberites del Mediterraneo, anche se questo carattere è condiviso con P. prototipus del Mar Nero (vedi la descrizione originale in van Soest 2002 Fig. 6C, p. 235).

P. mereui sp. nov. condivide con P. aquaedulcioris e P. lacustris la capacità di produrre corpi di resistenza (Annandale 1915). Tuttavia, P. aquaedulcioris e P. lacustris hanno un complemento spicolare con subtilostili e corpi di riposo senza apertura foraminale (Annandale 1914, 1915); inoltre P. aquaedulcioris possiede anche centrotiloti piegati e oxee (Annandale 1915).

Un'altra specie di acqua salmastra con analogie con P. mereui sp. nov. è P. collaris, ma per quest’ultima specie non è nota la produzione di corpi di resistenza, cosi come i tilostili sono sensibilmente più grandi (Annandale 1924; Tabella 3).

Forse una delle caratteristiche più interessanti di P. mereui sp. nov. è l’habitat peculiare nel quale vive la specie, caratterizzato dalle acque mixoaline della grotta.

Infatti, il ramo meridionale della Grotta del Bue Marino è una grotta anchialina/d’estuario dove i parametri fisico-chimici, come la salinità, il pH e la conducibilità dell'acqua, cambiano radicalmente nel corso dell'anno e a seconda della profondità. Lo stesso habitat è condiviso solo da un’altra specie congenerica, P. geracei (van Soest & Sass 1981), unica suberitidae segnalata in una grotta anchialine/d’estuario (Manconi et al. 2012), ma per la quale non sono stati descritti corpi di riposo. Solo 3 specie del genere Protosuberites sono stati segnalati fino ad ora in ambienti salmastri, ovvero Protosuberites aquaedulcioris (Annandale, 1914), Protosuberites lacustris (Annandale, 1915), e Protosuberites collaris (Annandale, 1924) provenienti dalle coste dell’Oceano Indiano.

È interessante notare che, P. aquaedulcioris e P. lacustris, nonché alcune altre specie della famiglia suberitidae, ad esempio Suberites sericeus Thiele 1898, sono in grado di produrre corpi di resistenza gemmule simili (Annandale 1915; Simpson & Fell 1974; Manconi & Pronzato del 2007, 2016).

Per quanto riguarda la morfologia dei corpi di resistenza, mentre la teca di spongina in S. sericeus, P. aquaedulcioris e P. lacustris è multistrato, senza un'apertura (foramen), quella di P. mereui sp. nov. è caratterizzata dalla presenza di un sublayer di spongina compatto e da una apertura foraminale dotata di un lungo collare.

La gemmulazione nelle spugne viene quindi interpretata come strategia di adattamento di successo per resistere alle dure condizioni ambientali (Simpson & Fell 1974; Pronzato e Manconi 1994, 1995; Manconi & Pronzato 2002, 2007, 2015, 2016). In sintesi, la presenza di corpi di resistenza in specie che vivono in acque salmastre, ma che appartengono ad un genere tipicamente marino, sostiene la teoria di una loro origine marina, con conseguenti adattamenti che le specie hanno adottato per far fronte ai repentini cambiamenti ambientali, principalmente in salinità.

Protosuberites mereui sp. nov. sembra essere vicina a P. denhartogi da un punto di vista morfologico (van Soest 1977; van Soest & de Kluijver 2003), tuttavia, le nostre analisi filogenetiche pur confermando l’assegnazione al genere Protosuberites, mostrano una situazione leggermente differente.

I nostri risultati molecolari (Fig. 5) in effetti rivelano che P. mereui sp. nov. forma un clade unico con Protosuberites sp. 'Panama', specie caratterizzata dalla presenza di tilostili in combinazione con tricodragmi (Nichols 2005), e che le due specie sono “sorelle” di P. denhartogi.

Tale risultato potrebbero essere spiegato dall’elevata plasticità di alcuni caratteri morfologici, come la forma e le dimensioni dei tilostili (Chombard et al. 1998) e dal fatto che la morfologia di questi ultimi possa essere influenzata da fattori ambientali (McDonald 2002). Pertanto, il fenomeno di evoluzione convergente potrebbe spiegare come, specie relativamente lontane da un punto di vista filogenetico, mostrino un alto livello di somiglianza per alcuni morfotratti.

La distanza genetica (distanza p) calcolata tra P. mereui sp. nov. e Protosuberites sp. 'Panama', è stata la più bassa rinvenuta nel nostro studio (2,9 ± 0.8). Tuttavia, questa distanza, per il phylum Porifera, viene segnalata come sufficiente a definire due specie distinte.

Infatti, valori significativi di distanza p (COI based), pari a circa 1,6%, sono stati sufficienti a distinguere specie criptiche strettamente legate al complesso Tedania (Tedania) ignis (Wulff 2006).

In sintesi, sia le analisi morfologiche che quelle molecolari confermano all'unanimità Protosuberites mereui sp. nov.

come nuova specie.

La presenza di corpi di resistenza con un'apertura foraminale, combinata con la presenza di rarissimi, piccoli e sottili tilostili con un corpo sinuoso e una tipica testa a forma di fungo, rappresentano i tratti diagnostici esclusivi per la nuova specie, caratteristiche mai riportate in spugne cavernicole Mediterranee del genere Protosuberites (vedi Pouliquen 1972,

Pulitzer Finali 1983; Corriero et al. 2000).

Ulteriori studi, tra cui il sequenziamento di altre specie Protosuberites dotate di corpi di resistenza, ci aiuterà a capire quando e con quale incidenza la criptobiosi sia apparsa nella storia evolutiva del genere e della famiglia.

Ringraziamenti

Questo lavoro è dedicato alla memoria del nostro amico e collega Luigi Mereu, speleologo e fotografo sardo, in riconoscenza del suo contributo nella ricerca condotta nella Grotta del Bue Marino e in memoria dell’esperienza condivisa con lui. Ringraziamo anche Alessandra Basolu, Roberto De Bellis, Francesco Delogu, Daniela Demurtas, Dario Milillo, Stefania Piquereddu e Gavino Pittalis per il loro aiuto durante le operazioni di campionamento.

 

 

 

Figura 1. Protosuberites mereui sp. nov. A. Forma incrostante (a secco) su frammento di roccia, con canali subdermali in evidenza e osculi sparsi. Il serpulide Ficopomatus enigmaticus è apprezzabile sulla destra.B. Ingrandimento dell’osculo. C. Esemplare su frammento di plastica (etanolo).



 

Figura 2. Protosuberites mereui sp. nov. Spicole e scheletro (SEM). A. Tilostilo liscio con testa subovale. B-C. Testa del tilostilo. D. Struttura dello scheletro con tilostili eretti. E. Dettaglio dell’osculo con tilostili a palizzata.



Figura 3. Protosuberites mereui sp. nov. Corpi di resistenza (gemmule simili). A. Corpo di resistenza di forma subovale (LM) con base piatta, cellule totipotenti (centro) e teca di spongina non armata da spicule. A1. Teca di spongina compatta con singolo foramen distale, con collare ben sviluppato. (LM). B. Rappresentazione schematica del corpo di resistenza. B1. Dettaglio del foramen con collare protruso. B-B1 per cortese concessione di R. Pronzato.



Letteratura citata

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